人脑源性神经营养因子和神经营养素3真核双表达载体的构建与鉴定
栗炳南
李卫东
林俊堂
丰慧根
1.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530032.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530033.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530034.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,453003
摘要：背景：脑源性神经营养因子(brain-derived ；neurotrophic factor，BDNF)和神经营养素3(Neurotrophines-3，NT-3)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-NT-3并对其进行鉴定。方法： BDNF和NT-3基因核心序列是通过直接PCR的方法从外周血单个核细胞的基因组DNA中获取。然后将BDNF的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建pIRES2-BDNF-EGFP载体，随后将NT-3 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中，最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体。实验通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。
<br> 结果与结论：DNA测序显示，提取的BDNF和NT-3均与基因库报道序列一致。构建的pIRES 2-BDNF-NT-3双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带，经Bam HⅠ/NotⅠ双酶切后切出IRES-NT-3片段，经Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后切出BDNF-IRES-NT-3片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示，此载体转染后的HEK293细胞均能表达BDNF和NT-3 mRNA和蛋白。结果证实，实验成功采用IRES序列构建了能分别表达的 BDNF 和 NT-3双基因真核表达载体。
关键词：组织构建组织工程脑源性神经营养因子神经营养素3真核双表达载体转染双PCR
分类号：R318(医用一般科学)
资助基金：新乡医学院重点领域招标课题(ZD2011-16)河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A180850)the Tender Subject of Key Research Areas of Xinxiang Medical University in 2011, (No. ZD2011-16)Key Projects in Scientific Research of Henan Provincial Education Department, (No.13A180850)
论文发表日期：2014-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 2369-2376 )
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