人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定
栗炳南
李卫东
林俊堂
丰慧根
原志庆
1.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530032.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530033.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530034.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530035.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,453003
摘要：背景:人向血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用.病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法.目标:构建双基因共表达载体plRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定.方法:是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到plRES2-EGFP多克隆位点构建成为plRES2-LIF-EGFP.人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从plRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入plRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体.通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达.结果与结论:DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp.构建的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/Notl双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/ Notl双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段.RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白.结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体.
关键词：组织构建组织工程白血病抑制因子血管内皮生长因子165真核双表达载体内部核糖体进入位点转染双PCR
分类号：R318(医用一般科学)
资助基金：Tender Subject of Key Research Areas of Xinxiang Medical University in 2011,(No.ZD2011-16)Key Projects in Scientific Research of Henan Provincial Education Department,(No.13A180850)Scientific Research Fund of Xinxiang Medical University,(No.2013QN117)Innovation Supporting Project of Xinxiang Medical University for Graduate Students Scientific Research,(No.YJSCX201231Y)Key Science and Technology Project of Henan Province,(No.122101310100)Henan Provincial Academy of Science and Technology Cooperation Project,(No.102106000017)新乡医学院重点领域招标课题(ZD2011-16)河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A180850)新乡医学院科研培育基金(2013QN117)新乡医学院研究生科研创新支持计划项目(YJSCX201231Y)河南省重大科技攻关项目(122101310100)河南省省院科技合作项目(102106000017)
论文发表日期：2014-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 3870-3877 )
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