人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定
栗炳南
李卫东
林俊堂
丰慧根
1.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530032.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530033.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530034.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,453003
摘要：背景：人胶质细胞源性神经营养因子(glial ；cel line - derived neurotrophic factor， GDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165， VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。<br> 目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-GDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。<br> 方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因，然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES 2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES 2-GDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。<br> 结果与结论：DNA测序显示，提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES 2-GDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带，经 Bam HI/Not I 双酶切后切出IRES-VEGF 165片段，经Bgl II/Not I双酶切后切出 GDNF-IRES-VEGF 165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。
关键词：组织构建组织工程胶质细胞源性神经营养因子血管内皮生长因子165真核双表达载体内部核糖体进入位点转染双PCR
分类号：R318(医用一般科学)
资助基金：the Tender Subject of Key Research Areas of Xinxiang Medical University in 2011, (No. ZD2011-16)Key Projects in Scientific Research of Henan Provincial Education Department, (No.13A180850)新乡医学院重点领域招标课题(ZD2011-16)河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A180850)
论文发表日期：2014-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 4675-4682 )
英文信息