sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

刘伟; 王杰; 幸永明; 李纯志; 陈昌伟; 赵宏; 龚德军

摘要：背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比，将基因通过慢病毒转染入宿主细胞，可以得到长期高效的持续表达，采取双/多基因共修饰治疗的策略，较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。<br>　　目的：构建 sox9基因慢病毒载体以及 LMP1基因慢病毒载体，并共转染兔骨髓间充质干细胞，观察 SOX9和LMP1基因的表达情况。<br>　　方法：双酶切从 GeneArt 提供的含 sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体，获得含sox9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列，并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-DsRed-Monomer载体，获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP)，以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞，观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。<br>　　结果与结论：测序结果显示质粒 pLMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致，成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达，RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在mRNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带 sox9基因的 Lenti-SOX9-GFP 慢病毒载体，以及红色荧光蛋白的携带 LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体，为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。