人基质金属蛋白酶3基因RNA慢病毒载体构建及在人退变髓核细胞中的鉴定
曹进
傅培荣
房晶
杨建坤
位华卫
李思源
高峰
西永明
1.青岛大学附属医院脊柱外科,山东省青岛市,2660032.青岛大学附属医院脊柱外科,山东省青岛市,2660033.青岛大学附属医院脊柱外科,山东省青岛市,2660034.青岛大学附属医院脊柱外科,山东省青岛市,2660035.青岛大学附属医院脊柱外科,山东省青岛市,2660036.青岛大学附属医院脊柱外科,山东省青岛市,2660037.青岛大学附属医院脊柱外科,山东省青岛市,2660038.青岛大学附属医院脊柱外科,山东省青岛市,266003
摘要：背景：抑制椎间盘细胞外基质的降解可以延缓椎间盘退变的进程，基质金属蛋白酶3是降解Ⅱ型胶原和蛋白多糖细胞外基质成分的关键酶。<br> 目的：构建人基质金属蛋白酶3特异性shRNA 重组慢病毒载体，感染人退变的髓核细胞，鉴定干扰效果。<br> 方法：根据基质金属蛋白酶3基因mRNA序列，设计4组靶向基质金属蛋白酶3基因的短发夹RNA序列，合成、退火形成双链DNA片段，与经过DNA内切酶Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞，对长出的克隆进行菌落 PCR 鉴定，并对阳性克隆进行测序及比对分析。通过转染293T 细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。用慢病毒质粒载体感染人退变的髓核细胞，荧光显微镜观察感染率，在72和96 h使用实时PCR和Western blot检测干扰效果。<br> 结果与结论：①酶切和测序两种方法结果证明4种质粒载体的插入序列完全正确，慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为(1-5)×108TU/mL。②含有GCC AGG CTT TCC CAA GCA AAT干扰序列的干扰效率最高，72和96 h基质金属蛋白酶3基因表达水平干扰分别为98%和72%，96 h基质金属蛋白酶3蛋白水平干扰57.2%。③实验成功构建了靶向人基质金属蛋白酶3基因RNA干扰慢病毒载体，为进一步研究基质金属蛋白酶3功能和用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。
关键词：组织构建软骨组织工程基质金属蛋白酶3RNA干扰慢病毒髓核细胞椎间盘退变基因转染国家自然科学基金
分类号：R318(医用一般科学)
资助基金：国家自然科学基金(81470104)
论文发表日期：2016-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：10( 947-956 )
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