提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法
徐莹1
张定棋2
慕永平1
陈佳美1
王清兰3
平键1
刘伟1
刘平2
1.上海中医药大学,上海中医药大学附属曙光医院,上海市中医药研究院肝病研究所,肝肾疾病病证教育部重点实验室,上海中医临床重点实验室,上海市 2012032.上海中医药大学,上海中医药大学附属曙光医院,上海市中医药研究院肝病研究所,肝肾疾病病证教育部重点实验室,上海中医临床重点实验室,上海市 201203;上海中医药大学,上海高校中医内科学 E-研究院,上海市 2012033.上海中医药大学,上海高校中医内科学 E-研究院,上海市 201203
摘要：背景:由于小鼠肝脏小、血管较细,其原代肝星状细胞分离的难度相对较大,且得率有限,难以满足体外实验需求.目的:建立小鼠原代肝星状细胞高效稳定的分离方法,提高小鼠原代肝星状细胞的得率与纯度,为研究肝纤维化的机制奠定实验基础.方法:取成年雄性C57BL/6小鼠,以无钙镁离子的前灌流液经门静脉充分灌注肝脏,再先后以1 g/L链霉蛋白酶和0.7 g/LⅣ型胶原酶灌注,使用Nycodenz进行梯度密度离心,获取中间层原代肝星状细胞,锥虫蓝染法观察肝星状细胞活力,流式细胞法检测细胞纯度,免疫荧光法检测Desmin表达,并于倒置显微镜下观察细胞培养3,5,7 d后的形态变化,PCR法检测培养3,5,7 d后α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白基因表达情况.结果与结论:①每只小鼠肝脏可获得肝星状细胞(5.5±0.4)×106个,锥虫蓝检测细胞活力均大于95%,流式细胞法检测细胞纯度为94%,免疫荧光检测细胞高表达Desmin;②随着体外培养时间的延长,可见原代肝星状细胞逐渐由圆形向星型发展;③随培养天数增长,α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐升高;④结果提示,实验成功建立了高效分离小鼠肝星状细胞的方法,可为获得高纯度、高细胞活力的小鼠原代肝星状细胞提供技术方案,也为肝纤维化的机制研究提供技术保障.
关键词：肝星状细胞细胞分离技术原代细胞细胞外基质荧光鉴定肝纤维化细胞得率国家自然科学基金
分类号：R394.2(医学遗传学)
资助基金：国家自然科学基金(81530101)国家自然科学基金(81703681)上海市青年科技英才"扬帆计划"项目(17YF1419800)中国博士后科学基金(2016M601643)
论文发表日期：2018-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 3376-3380 )
英文信息