利用同源重组构建大鼠甘油二酯激酶γ(DGKγ)慢病毒过表达载体
李蕾
谢建山
杜家政
师亮
崔慧林
山西医科大学组织胚胎学教研室,山西省太原市,030001
摘要：背景:慢病毒载体作为外源性转基因载体己被广泛应用,但是大鼠甘油二酯激酶γ(diacylglycerol kinase γ,DGKγ)基因慢病毒载体未见报道.目的:用同源重组的方法构建大鼠DGK γ慢病毒过表达载体.方法:提取成年SD大鼠脑组织总RNA,以反转录得到的cDNA作为模板,通过PCR反应分段扩增大鼠DGKγ基因CDS区5'端1 029 bp和3'端1 362 bp,用同源重组技术将这2个片段与线性化载体进行定向连接,构建CMV-rat DGK γ-GFP慢病毒载体并进行PCR扩增及测序鉴定.经293T细胞包装后产生慢病毒,收集慢病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达并应用实时荧光定量PCR和Westernblotting法检测细胞中DGKγmRNA和蛋白的表达.结果 与结论:CMV-rat DGK γ-GFP慢病毒载体经PCR扩增和测序鉴定构建成功;经CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒感染后的293T细胞,荧光显微镜下呈GFP阳性,实时荧光定量PCR显示DGKγmRNA的表达较空载体组显著升高(P＜0.01),Western blotting显示DGKγ蛋白表达较空载体组极显著升高(P＜0.001).提示:成功构建了大鼠DGKγ慢病毒过表达载体,DGKγ在293T细胞有效高表达.
关键词：甘油二酯激酶γDGKγ同源重组慢病毒载体过表达
分类号：R496(康复医学)R394.3(医学遗传学)R318(医用一般科学)
资助基金：山西省优势重点学科项目(2011-2014)山西医科大学基础医学科技培植基金计划(201410)山西医科大学科技创新项目(01200719)
论文发表日期：2020-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 260-264 )
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