利用慢病毒感染构建稳定敲低Atg5基因的RAW264.7细胞系
冼国炎
陈蔚深
张紫机
叶勇裕
潘柏祺
郑霖力
盛璞义
1.中山大学附属第一医院关节外科,广东省广州市 5100802.中山大学附属第一医院关节外科,广东省广州市 5100803.中山大学附属第一医院关节外科,广东省广州市 5100804.中山大学附属第一医院关节外科,广东省广州市 5100805.中山大学附属第一医院关节外科,广东省广州市 5100806.中山大学附属第一医院关节外科,广东省广州市 5100807.中山大学附属第一医院关节外科,广东省广州市 510080
摘要：背景:巨噬细胞自噬在调节免疫系统和炎症反应中起到关键作用,而敲低Atg5基因可以特异性抑制细胞自噬的发生.由于传统siRNA转染方法存在瞬时性和不彻底性等问题,构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7巨噬细胞系对于研究自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制有重要的价值和意义.目的:利用慢病毒感染的方法构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7巨噬细胞系,为研究巨噬细胞自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制提供底盘细胞.方法:构建带有绿色荧光信号、Puro抗性基因和敲低Atg5基因的重组表达载体(HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro)转染293T细胞得到慢病毒质粒系统,采用获取的慢病毒感染RAW 264.7细胞,在倒置荧光显微镜下观察病毒感染细胞的绿色荧光信号,嘌呤霉素抗性筛选,流式细胞分选得到高纯度的感染细胞,采用RT-qPCR和Western blot验证Atg5基因的敲低效率.结果与结论:DNA测序结果表明Atg5基因干扰序列均正确插入表达载体,HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro表达载体构建成功.慢病毒质粒感染RAW 264.7细胞系后,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光,流式细胞分选仪可见绿色荧光蛋白阳性细胞群.RT-qPCR和Western blot检测结果表明筛选出的RAW 264.7细胞系中Atg5基因表达水平显著下降(P<0.05),表明稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系构建成功.
关键词：慢病毒基因基因敲低自噬蛋白细胞学细胞群巨噬细胞
分类号：R459.9(治疗学)R392.1(医学免疫学)R318(医用一般科学)
资助基金：国家自然科学基金(81672149)广东省自然科学基金(2017A030313593)国家自然科学基金(81802179)
论文发表日期：2021-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 84-89 )
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