高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞
王晗月1
李富荣2
杨晓菲1
胡巢凤3
1.暨南大学基础医学院病理生理学系,广东省广州市 510632;暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)转化医学协同创新中心,广东省深圳市 5180202.暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)转化医学协同创新中心,广东省深圳市 5180203.暨南大学基础医学院病理生理学系,广东省广州市 510632
摘要：背景:胰岛细胞移植是治疗糖尿病最有效的方法之一,然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用.在体外进行肝细胞向胰岛β细胞的直接重编程是解决该问题的一个新思路,但肝细胞向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程.目的:利用构建的CRISPR/dCas9-Pumilio系统(Casilio系统),通过改造向导RNA序列,与转录激活子PUFa-P65-HSF1结合,实现高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞.方法:采用脂质体转染法将Casilio体系(PNM)转染至HEK293T细胞系,靶向激活肝细胞内源PNM(Pdx1,Ngn3及MafA)基因,利用实时荧光定量PCR及免疫荧光检测内源PNM的表达.利用携带Ins-promoter-EGFP的慢病毒构建增强型绿色荧光蛋白稳定表达的Ins-EGFP HepG2细胞系,PiggyBac(PB)转座系统在此细胞系中构建核酸内切酶失活的Cas9(dCas9)和PUFa-P65-HSF1稳定表达的稳转细胞系.用脂质体向稳转细胞系分别转染针对PNM的向导RNA,然后实时荧光定量PCR和免疫荧光检测内源基因PNM的表达水平,并观察重编程效率.结果与结论:①实验在293T细胞系中验证了Casilio体系对内源基因的激活作用;②RT-PCR、Western Blot及免疫荧光检测验证了稳转细胞系中EGFP、dCas9和PUFa-P65-HSF1的表达;③实时荧光定量PCR证实靶向激活PNM的新型Casilio体系可实现内源PNM基因表达明显上调,直接重编程效率为10％-15％;④上述数据说明基于CRISPR/dCas9的新型Casilio体系,可成功激活肝脏内源PNM基因,可初步实现肝细胞系直接重编程为胰岛样细胞.
关键词：体细胞胰岛样细胞肝细胞基因转染糖尿病CRISPR/dCas9因子蛋白通路
分类号：R459.9(治疗学)R363(病理学)R364(病理学)
资助基金：国家自然科学基金(81800685)国家自然科学基金(81670702)广东省自然科学基金(2018A030310039)自由探索项目(JCYJ20170307100154602)
论文发表日期：2021-03-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 1056-1063 )
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