通络生骨胶囊含药血清对破骨细胞及Toll样受体4/核因子KB信号通路的影响

范思奇; 曾平; 农焦; 刘金富; 钱晓芬

摘要：背景:在激素性股骨头坏死发病机制中Toll样受体4(Toll-link receptors 4,TLR4)信号通路异常发挥着重大的作用,调控TLR4有望成为有效治疗激素性股骨头坏死的突破点.目的:研究通络生骨胶囊对破骨细胞分化过程中TLR4信号传导通路的影响,了解通络生骨胶囊对破骨细胞分化抑制过程的分子生物学机制.方法:将28只12周龄的C57BL/6小鼠随机分为通络生骨胶囊高、中、低剂量灌胃组[设置0.91 g/(kg·d)为中剂量,该浓度剂量的2倍为高剂量,0.5倍为低剂量]和生理盐水灌胃组,每日1次,持续灌胃14 d.末次给药8h后,通过腹主动脉取血来制备含药血清和对照血清组.采用核因子κB受体激活蛋白配体和巨噬细胞集落刺激因子诱导因子联合诱导RAW264.7细胞株,将细胞分为5组:正常组、生理盐水组、通络生骨胶囊含药血清低、中、高浓度组.经CCK-8法观察含药血清对细胞增殖的影响后,选择剂量浓度为20％的含药血清在诱导的第4天干预破骨细胞前体,每组分别在诱导24,48,72,96 h观察破骨细胞前体的生长形态及融合程度,第8天通过TRAP染色来观察破骨细胞的数目,通过Western blot检测关键蛋白TLR4、核因子κBp65的表达,ELISA检测细胞上清液肿瘤坏死因子α的水平.实验方案经广西中医药大学动物实验伦理委员会批准.结果与结论:①通络生骨胶囊低、中、高剂量组培养液中肿瘤坏死因子α水平均低于正常组(P＜0.01),通络生骨胶囊低剂量组与中剂量组之间差异无显著性意义;②通络生骨胶囊高、中、低剂量组TLR4蛋白表达均显著低于正常组(P＜0.05);通络生骨胶囊组中剂量、高剂量组核因子κBp65蛋白表达显著低于正常组(P＜0.05);其中TLR4、核因子κBp65蛋白的表达在通络生骨胶囊中剂量组中抑制效果最为有效;③结果说明,通络生骨胶囊治疗激素性股骨头坏死的机制之一可能是通过抑制TLR4//NF-κB信号通路,减少了下游的炎症因子肿瘤坏死因子α的释放,改善了激素性股骨头坏死中的炎症环境;另一方面又抑制了破骨细胞活性,使骨吸收减弱,改善了激素性股骨头坏死中的骨代谢平衡.