敲减ATR基因对大鼠骨髓内皮祖细胞衰老及其功能的影响

唐蜜; 秦臻; 韦正新; 倪鸣; 柴小康

摘要：背景:内皮祖细胞在血管内皮更新及修复中发挥重要作用,利用体外扩增的自体内皮祖细胞移植促进缺血部位血管新生,现已成为防治缺血性心血管疾病的新策略,但取自老年机体的内皮祖细胞在体外扩增中会出现细胞衰老迹象,难以发挥修复能力,研究表明DNA损伤与细胞衰老关系密切,DNA损伤检测点是调控DNA损伤的重要关卡.目的:通过慢病毒RNA干扰技术敲减大鼠骨髓内皮祖细胞中的ATR基因,探讨其在内皮祖细胞衰老进程中的作用.方法:将大鼠骨髓源内皮祖细胞进行分离、培养并鉴定,将分离出的内皮祖细胞继续培养至第3代,随机分为3组:未转染组(空白组)、阴性对照组、基因敲减组(ATR-RNAi组).未转染组正常培养,阴性对照组、基因敲减组分别予以慢病毒RNAi及慢病毒ATR-RNAi稳定转染至第3,6天,通过qRT-PCR和Western blot检测各组细胞中ATR mRNA和蛋白表达水平,β-半乳糖苷酶染色检测各组细胞的衰老情况,MTT比色法检测各组细胞的增殖能力,Transwell实验和体外血管生成试剂盒分别检测各组细胞迁移能力及成血管功能,流式细胞术检测各组细胞周期变化.结果与结论:①与未转染组比较,ATR-RNAi组内皮祖细胞表达ATR mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.01),表明ATR基因表达被有效敲减;②与未转染组比较,ATR-RNAi组蓝染细胞数量减少,表明衰老程度明显减轻(P<0.01);③与未转染组相比,ATR-RNAi组细胞增殖、迁移和成血管功能明显增强(P<0.05);④与未转染组比较,ATR-RNAi组处于G1、G2期的细胞百分率明显减少,S期细胞百分率显著增多(P<0.05);⑤结果表明,敲减ATR基因表达可以延缓内皮祖细胞的衰老进程,同时增强内皮祖细胞的功能,减轻细胞周期的停滞.