三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定

高婷; 马小红; 李晓荣

摘要：背景:卵巢颗粒细胞作为卵泡内主要的功能细胞,通过复杂的缝隙连接与卵母细胞进行细胞间的信息物质交流,调控着卵母细胞的生长与成熟;随着外泌体研究的深入,发现其积极参与了细胞间的通讯,并携带多种遗传物质,可通过自分泌或旁分泌方式被细胞吸收,调节细胞增殖,参与疾病生理病理过程.由此可见,卵巢颗粒细胞的外泌体分泌能力及提取鉴定对于研究女性生殖具有重要的意义.目的:探讨人卵巢颗粒细胞分泌外泌体的能力及不同来源人卵巢颗粒细胞外泌体之间的差异.方法:体外培养SVOG细胞(人卵巢颗粒细胞系)、KGN细胞(人卵巢颗粒细胞瘤细胞)、人原代卵巢颗粒细胞;采用超高速离心法分别从3种不同来源卵巢颗粒细胞上清中分离提取外泌体,通过透射电子显微镜、纳米跟踪技术、蛋白质印迹法分别鉴定其形态结构、粒径大小、阳性相关特异性蛋白CD63、TSG101及阴性标记蛋白Calnexin的表达.结果与结论:①SVOG细胞、KGN细胞、人原代卵巢颗粒细胞的细胞核均为圆形或椭圆形,核大,核仁部分蓝染,细胞浆呈淡红色;SVOG细胞、KGN细胞呈长梭形或多边形,形态不规则,人原代卵巢颗粒细胞多呈突起或梭形,细胞伪足细长,相互紧密交织;②3种不同来源人卵巢颗粒细胞免疫荧光均阳性表达FSHR,且阳性表达率>95％;③3种不同细胞上清液分离的外泌体均呈双层膜结构杯托样;④纳米跟踪分析SVOG细胞、KGN细胞、人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体的平均粒径分别为(183.5±4.9),(125.3±1.0),(171.1±2.0)nm,其中人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体的分泌水平最高,KGN细胞来源外泌体的粒径最小,SVOG细胞来源外泌体大小较接近人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体;⑤蛋白质印迹法检测显示3种不同来源卵巢颗粒细胞来源外泌体特异性相关蛋白CD63、TSG101均呈阳性表达,而Calnexin不表达;⑥结果表明,采用超高速离心法能够成功分离提取不同卵巢颗粒细胞来源外泌体,KGN细胞来源外泌体粒径最小,SVOG细胞及人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体粒径较接近,以人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体的分泌水平最高.