沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响
张艺1
吴道秋1
汤弘婷1
李梦醒2
刘虹麟3
陈忠良4
李琴山5
1.贵州医科大学,医学检验学院临床生物化学教研室,贵州省贵阳市 5500042.贵州医科大学附属医院,血液科,贵州省贵阳市 5500043.北京中日友好医院临床医学研究所,北京市 1000004.贵州医科大学,组织工程与干细胞实验中心,贵州省贵阳市 5500045.贵州医科大学,医学检验学院临床生物化学教研室,贵州省贵阳市 550004;贵州医科大学附属医院,贵州省产前诊断中心,贵州省贵阳市 550004
摘要：背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究.由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义.目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响.方法:采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率.通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响.结果 与结论:①设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3),均成功连入Tet-on载体,且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞;②实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P<0.05),且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复;③集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P<0.05);Western blot检测敲低MKRN1后,增殖细胞核抗原表达下调,细胞凋亡相关指标BAX表达增加,Bcl2表达下调,Bcl2/BAX的比值下调(P<0.001);④结论:采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株,且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖,并促进其凋亡.通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础,也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考.
关键词：MKRN1基因四环素诱导调控表达系统基因表达调控慢病毒
分类号：R446(诊断学)R318(医用一般科学)R496(康复医学)
资助基金：国家自然科学基金(81960476)国家自然科学基金(81460365)国家自然科学基金(81760039)国家自然科学基金(81402451)国家自然科学基金(82173378)贵州省卫生健康委基金(gzwkj2021-160)
论文发表日期：2023-08-21
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：7( 3838-3844 )
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