黄芪桂枝五物汤减弱椎间盘终板软骨细胞线粒体损伤和氧化应激

董佳安; 刘汝银; 岳宗进; 徐向阳; 王政臻

摘要：背景:黄芪桂枝五物汤对椎间盘退行性疾病有一定的保护作用.线粒体自噬在调控细胞线粒体损伤和氧化应激中发挥着重要的作用,但黄芪桂枝五物汤对椎间盘终板软骨细胞线粒体自噬的影响仍不明确.目的:探讨黄芪桂枝五物汤对过氧化氢诱导椎间盘终板软骨细胞损伤的影响及其可能的分子作用机制.方法:提取大鼠椎间盘终板软骨细胞,将细胞分为5组,其中黄芪桂枝五物汤低、中、高剂量组分别用6.25,12.5,25 mg/mL黄芪桂枝五物汤培养液培养细胞24 h,而正常组和模型组不添加药物.之后除正常组外,模型组和黄芪桂枝五物汤各剂量组中添加400μmol/L的H2O2继续处理细胞2 h.采用CCK-8法检测细胞增殖情况;比色法检测乳酸脱氢酶、ATP、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛水平;免疫荧光法检测细胞线粒体膜电位变化;流式细胞术检测活性氧和细胞凋亡率;细胞免疫荧光双染检测细胞线粒体自噬的情况;采用siRNA进行细胞转染,蛋白免疫印迹法检测帕金森病相关基因(Parkinson-related genes,Parkin)、LC3Ⅱ和p62蛋白表达的情况;细胞转染Parkin腺病毒过表达载体,检测细胞存活率.结果与结论:①与模型组比较,黄芪桂枝五物汤处理显著提高了软骨细胞存活率,升高软骨细胞内ATP、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和线粒体膜电位水平,有效降低细胞的凋亡率(P<0.05,P<0.01);②黄芪桂枝五物汤处理后,软骨细胞中乳酸脱氢酶活性、活性氧和丙二醛水平较模型组显著降低(P<0.01);③Parkin siRNA显著降低了过氧化氢诱导的细胞线粒体自噬(P<0.01),细胞存活率和ATP水平明显升高(P<0.01),细胞中的活性氧水平、丙二醛含量和凋亡率均明显降低(P<0.01);④与模型组相比,黄芪五物桂枝汤处理能够减弱过氧化氢引起的Parkin和LC3Ⅱ蛋白水平升高(P<0.05,P<0.01);而黄芪桂枝五物汤处理组中的p62蛋白水平显著高于模型组(P<0.01);⑤过表达Parkin减弱了高剂量黄芪桂枝五物汤对H2O2处理细胞存活率的保护作用;⑥提示黄芪桂枝五物汤能有效抑制过氧化氢诱导的椎间盘终板软骨细胞线粒体损伤和氧化应激,其保护机制可能与减弱Parkin调节的线粒体自噬有关.