DOI: 10.12307/2025.025
过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株
郭大鑫1
范苏苏2
朱振东2
侯建红1
张旋2
1.云南省第三人民医院/大理大学第二附属医院,云南省 昆明市 6500112.昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室/现代生物医药产业学院,云南省 昆明市 650500
摘要：背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚.构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具.
目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础.
方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段.将目的基因定向接入经AgeI/NheI酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平.
结果与结论:①测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;②过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×109 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×109 TU/mL;③确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3 μg/mL;④过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;⑤过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调.结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株.
关键词：慢病毒载体溶质载体家族1成员5SLC1A5过表达敲低RAW264.7细胞稳转细胞株
分类号：R459.9(治疗学)R373(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)R684.3(骨科学（运动系疾病、矫形外科学）)
论文发表日期：2025-03-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 1414-1421 )
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