一种同时取硬脑膜及颈深淋巴结的实验方法

谌子龙; 吴铭杰; 陈晓婧; 周西彬; 周春祥

doi:10.12307/2025.732

摘要：背景:脑膜淋巴管可引流脑脊液和β-淀粉样蛋白,促进T淋巴细胞运输以及归巢至颈深淋巴结.简单快捷、步骤明确的硬脑膜分离方法以及颈深淋巴结的准确定位,可以为神经退行性疾病的研究提供有力的支持. 目的:建立一种便捷实用的硬脑膜及颈深淋巴结剥取方法. 方法:取3月龄ICR小鼠,麻醉后于枕大池注射埃文斯蓝和示踪剂进行颈深淋巴结定位,于锁骨上方约5 mm作长约3 cm的中线切口后,钝性分离浅脂肪和筋膜,牵拉侧胸锁乳突肌,暴露颈深淋巴结,在体式显微镜下摘取淋巴结,-80 ℃冻存;随后剪断小鼠颈部,分离头部皮肤肌肉暴露出完整颅骨结构,使用剪刀自枕骨大孔处沿顶骨下沿离断一周,分离颅骨和脑组织,获取完整的颅骨顶部.分别将取下来的颅骨顶部泡在40 g/L多聚甲醛24 h,120 g/L多聚甲醛固定24 h,120 g/L多聚甲醛固定10,20,30,40 min后,剥离硬脑膜结构.分别采用示踪剂对脑膜淋巴管、颈深淋巴引流能力进行验证,淋巴管内皮透明质酸受体1免疫荧光法鉴定脑膜淋巴管. 结果与结论:①小鼠注射埃文斯蓝15 min后于颈深淋巴结内观察到明显蓝染.②颅骨置于120 g/L多聚甲醛固定24 h,可使硬脑膜与颅骨的连接不再紧密,剥离硬脑膜结构更为容易,且形状完整;与传统40 g/L多聚甲醛相比,120 g/L多聚甲醛固定的硬脑膜更具韧性,剥离时更能保持完整;120 g/L多聚甲醛短时间固定取脑膜以30-40 min较佳.③颈深淋巴结冰冻切片有明显示踪剂存在,硬脑膜可见完整的脑膜淋巴管存在,淋巴管尾端可见示踪剂;颈深淋巴结及硬脑膜淋巴管的淋巴管内皮透明质酸受体1免疫荧光染色均阳性.④结果说明,120 g/L多聚甲醛固定24 h为较佳的剥离浓度与时间,该浓度下硬脑膜形态舒展、韧性较好,剥离后较完整,利于后期使用;埃文斯蓝定位及示踪剂和免疫荧光验证的颈深淋巴结位置准确,可作为研究各类神经退行性疾病的基础.