高糖微环境中程序性细胞死亡受体1抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

韩念荣; 黄异飞; 艾克热木·吾斯曼; 刘岩路; 胡炜

doi:10.12307/2026.086

摘要：背景:程序性细胞死亡受体1和神经前体细胞发育下调蛋白4参与调控成骨细胞的分化,但这两者间的相互作用及调控机制仍需进一步研究阐明. 目的:探讨高糖环境中程序性细胞死亡受体1调控神经前体细胞发育下调蛋白4影响大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的机制. 方法:①采用免疫沉淀-质谱联用技术检测程序性细胞死亡受体1的交互蛋白,采用免疫共沉淀验证程序性细胞死亡受体1与神经前体细胞发育下调蛋白4的交互作用,采用免疫荧光检测程序性细胞死亡受体1和神经前体细胞发育下调蛋白4的定位.②将第3代大鼠骨髓间充质干细胞随机分为正常糖组(5.6 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、程序性细胞死亡受体1敲减空载组、程序性细胞死亡受体1敲减组、程序性细胞死亡受体1过表达空载组、程序性细胞死亡受体1过表达组,采用Western blot检测神经前体细胞发育下调蛋白4的蛋白表达.③将第3代大鼠骨髓间充质干细胞随机分为正常糖组(5.6 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、神经前体细胞发育下调蛋白4敲减组,采用qRT-PCR检测神经前体细胞发育下调蛋白4及成骨标志物OSX、Runt相关转录因子2 mRNA表达,茜素红S染色和碱性磷酸酶染色评估成骨分化能力,Western blot检测Runt相关转录因子2、OSX、AKT、PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达.④随后在程序性细胞死亡受体1过表达的同时进行神经前体细胞发育下调蛋白4敲减处理,开展回复实验,观察细胞成骨分化能力变化. 结果与结论:①免疫沉淀-质谱联用技术、免疫共沉淀和免疫荧光实验显示神经前体细胞发育下调蛋白4是程序性细胞死亡受体1的交互蛋白,程序性细胞死亡受体1与神经前体细胞发育下调蛋白4共定位;②神经前体细胞发育下调蛋白4敲减组程序性细胞死亡受体1的mRNA与蛋白表达水平较高糖组降低(P<0.05);③神经前体细胞发育下调蛋白4敲减组大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化增强,激活PI3K/AKT通路;④程序性细胞死亡受体1过表达+神经前体细胞发育下调蛋白4敲减组的成骨细胞分化能力较程序性细胞死亡受体1过表达+神经前体细胞发育下调蛋白4敲减空载组升高,并激活PI3K/AKT通路.结果表明:程序性细胞死亡受体1能够与神经前体细胞发育下调蛋白4相互调节,影响PI3K/AKT通路活性,抑制骨髓间充质干细胞向成骨方向分化.