Atrophin-1全长基因稳定转染和瞬时转染真核细胞系的表达分析
张鑫
顾卫红
王国相
1.卫生部中日友好医院运动障碍与神经遗传病研究中心,北京,1000292.卫生部中日友好医院运动障碍与神经遗传病研究中心,北京,1000293.卫生部中日友好医院运动障碍与神经遗传病研究中心,北京,100029
摘要：目的 建立正常(CAG重复次数为19次)和异常(CAG重复次数为82和66次)atrophin-1[齿状核红核苍白球路易体萎缩(DRPLA)致病基因]全长基因真核表达体系,通过观察细胞形态及蛋白质表达水平和分布情况,比较稳定转染和瞬时转染两种细胞表达体系,为进一步研究建立良好的细胞模型.方法 基于已构建的GFP-atrophin-1-Q19/Flp-In TREx293和GFP-atrophin-1-Q82/Flp-In TREx293两种稳定转染细胞株.利用四环素调控系统Tet-on诱导表达.正置荧光显微镜观察正常与异常atrophin-1融合蛋白在细胞中的表达定位,电子显微镜观察细胞超微结构的改变;脂质体介导法将重组真核表达质粒GFP-atrophin-1-Q19和GFP-atrophin-1-Q66瞬时转染293T和SH-SY5Y细胞,HE染色、倒置荧光显微镜和电子显微镜分别观察细胞形态结构、蛋白质表达定位和细胞超微结构,Western blotting榆测atrophin-1融合蛋白表达水平.结果 在稳定转染体系中,绿色荧光信号大多位于细胞核内,异常蛋白质呈不均匀分布且有少数聚集现象;电子显微镜观察异常细胞胞核结构欠完整,核膜皱缩,核内结构紊乱.在瞬时转染293T细胞体系中,HE染色可见异常细胞核内形成粉紫色嗜酸性小体;大量atrophin-1融合蛋白在核内呈点状聚集现象;电子显微镜观察异常细胞核膜皱缩严重,核内大量电子致密物沉积且核仁消失;Western blotting检测均表达atrophin-1融合蛋白.在转染的SH-SY5Y细胞体系中,蛋白质表达定位及Western blotting检测结果与转染293T细胞基本一致.结论 包含异常扩增多聚谷氨酰胺链的atrophin-1融合蛋白在真核表达体系中可产生明显的核内聚集现象,并引起细胞形态改变,此为研究DRPLA核内包涵体的形成及其在发病中的作用,以及进一步的干预治疗奠定了理论基础.
关键词：脊髓小脑共济失调基因转染细胞培养的显微镜检查荧光
论文发表日期：2011-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 76-81 )
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