靶向人NHE-1RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立
方伯言1
黄美风2
1.航天中心医院神经内科,北京,1000492.辽宁医学院附属第一医院神经内科
摘要：目的:构建靶向人钠氢交换蛋白-1(NHE-1)RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体,感染SH-SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进一步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础.方法:利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA(miRNA)的重组干扰质粒pcDNA(TM)6.2-GW/miR和阴性对照质粒DcDNA(TM)6.2-GW/neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NHE-1 mRNA表达变化,筛选最佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数(MOI)值梯度试验确定靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值,以最佳条件感染SH-SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内pH值.结果:聚合酶链反应(PCR)提示最佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1 mRNA表达;靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值为160.当最佳MOI值为160时,NHE-1 miRNA腺病毒感染24、48和72h后SH-SY5Y细胞内pH值分别为5.97±0.03、5.98±0.02和5.98±0.02;空载体对照组为6.05±0.04、6.04±0.07和6.03±0.05;空白对照组为6.03±0.06、6.05±0.04和6.03±0.04.不同测量时间点,SH-SY5Y细胞内pH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(24h:P=0.002.0.015;48h:P=0.030,0.012;72h:P=0.018,0.010);但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点(24、48和72h)SH-SY5Y细胞内pH值差异元统计学意义(P=0.762).结论:最佳靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供一种有效工具.
关键词：钠氢反向转运物RNA干扰酸碱平衡腺病毒科遗传载体转染聚合酶链反应细胞培养的
资助基金：高等学校科研项目(20060524)辽宁省自然科学基金(20082179)
论文发表日期：2011-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 434-439 )
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