耐药细胞源性外泌体递送的miR-21-5p通过靶向PDCD4促进骨肉瘤增殖和顺铂耐药
孙超
孟晨阳
赵佳莉
窦蕊
冯卫
郭世炳
010020 呼和浩特,内蒙古医科大学第二附属医院骨科
摘要：目的 通过验证骨肉瘤顺铂耐药细胞分别转染 miR-21-5p 和程序性细胞死亡蛋白 4(PDCD4)后,检测其外泌体源 miR-21-5p 及其靶基因对骨肉瘤耐药性的调控作用;荷瘤实验验证动物血清外泌体miR-21-5p 的变化和肿瘤组织中相关基因的表达,探究骨肉瘤耐药细胞外泌体 miR-21-5p 与靶基因的相关性及其可能的作用机制.方法 (1)通过细胞增殖和迁移实验检测过表达或敲低 miR-21-5p 载体转染的顺铂耐药细胞分泌的外泌体与骨肉瘤细胞共培养的细胞增殖能力和迁移水平;蛋白质印迹法(WB)和定量逆转录聚合酶反应(qRT-PCR)实验检测 PDCD4、多药耐药基因 1(MDR1)、微管相关蛋白轻链 3(LC3)、自噬相关基因 Beclin1(Beclin1)、自噬相关基因 5(Atg5)的蛋白和 miRNA 表达水平.(2)通过 TargetScan 在线工具筛选与验证骨肉瘤细胞 miR-21-5p 的靶基因.qRT-PCR 验证 U2OS 及其耐药细胞源外泌体中 PDCD4 的 mRNA 差异表达;通过细胞增殖和迁移实验检测过表达或敲低 PDCD4 载体转染的顺铂耐药细胞中 PDCD4 对细胞增殖能力和迁移水平的影响;WB 和 qRT-PCR 实验检测 PDCD4、MDR1、LC3、Beclin1、Atg5 的蛋白和 miRNA表达水平.(3)观察各组成瘤裸鼠肿瘤生长情况,分析血清外泌体粒径及 CD81、CD63 的蛋白表达,WB 和qRT-PCR 检测裸鼠血清外泌体中 miR-21-5p、PDCD4 的蛋白和 mRNA 表达水平.免疫组化检测成瘤裸鼠肿瘤组织中相关基因的表达.结果 (1)miR-21-5p 过表达或敲低载体转染的顺铂耐药细胞差异表达系统结果表明,与 U2OS+Exo 组相比,U2OS+miR-21-5p mimics(模拟物)/Exo 组细胞增殖率和迁移率均显著增高(P ﹤ 0.0001,P ﹤ 0.01),PDCD4 的蛋白和 mRNA 表达水平均显著降低(分别为 P ﹤ 0.05 和 P ﹤ 0.01),而LC3(LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ)、MDR1、Beclin1、Atg5 的蛋白和 mRNA 表达水平均显著升高(分别为 P ﹤ 0.01 和P ﹤ 0.001).(2)TargetScan 在线工具预测的 PDCD4 是 miR-21-5p 的潜在靶基因,其 mRNA 的 3'非翻译区(3'UTR)中存在 miR-21-5p 的结合位点;PDCD4 过表达或敲低载体转染的 U2OS/DDP 细胞差异表达实验表明,与对照组相比,PDCD4 过表达组细胞增殖率和迁移率显著下降(P ﹤ 0.01,P ﹤ 0.001),而 miR-21-5p模拟物加 PDCD4 过表达组细胞增殖率和细胞迁移率显著升高(P ﹤ 0.05,P ﹤ 0.01);PDCD4 过表达组细胞中 PDCD4 的蛋白表达水平显著升高(P ﹤ 0.001),LC3(LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ)、MDR1、Beclin1、Atg5 的蛋白和mRNA 表达水平均显著降低(P ﹤ 0.01);miR-21-5p 模拟物加 PDCD4 过表达组细胞中 Beclin1 的蛋白表达,miR-21-5p、MDR1、Beclin1 的 mRNA 表达水平均显著升高(P ﹤ 0.05,P ﹤ 0.0001,P ﹤ 0.001,P ﹤ 0.05).(3)成瘤裸鼠在药物干预后,与对照组相比,miR-21-5p 模拟物组裸鼠肿瘤体积的增殖速度显著加快,终末肿瘤重量显著增大;裸鼠血清外泌体中 miR-21-5p 的 mRNA 表达水平显著升高(P ﹤ 0.001),PDCD4 的 mRNA 表达水平显著降低(P ﹤ 0.001);抑制剂组、PDCD4 过表达组、miR-21-5p 模拟物加 PDCD4 过表达组裸鼠血清外泌体中 miR-21-5p 的 mRNA 表达水平均显著降低(P ﹤ 0.01,P ﹤ 0.001,P ﹤ 0.01);PDCD4 的 mRNA 表达水平均显著升高(P ﹤ 0.01,P ﹤ 0.001,P ﹤ 0.01).免疫组化结果表明,与对照组相比,miR-21-5p 模拟物组裸鼠肿瘤组织中 ① PDCD4 的阳性表达减少;LC3、MDR1、Beclin1 和 Atg5 的阳性表达增多;② 抑制剂组、PDCD4 过表达组、miR-21-5p 模拟物加 PDCD4 过表达组肿瘤组织中 PDCD4 的阳性表达均有所增多;LC3、MDR1、Beclin1和 Atg5 的阳性表达均有所减少.结论 (1)miR-21-5p 可以促进骨肉瘤细胞的增殖与侵袭;(2)双荧光素酶报告实验证明,PDCD4 是 miR-21-5p 的靶基因;(3)miR-21-5p 可靶向抑制 PDCD4 的表达,促进 MDR1 与自噬相关因子的表达;(4)miR-21-5p靶向 PDCD4调节骨肉瘤顺铂耐药细胞的增殖、侵袭和耐药过程.
关键词：外泌体骨肉瘤抗药性肿瘤微 R-21-5p程序性细胞死亡蛋白4
分类号：R738.1(运动系肿瘤)
资助基金：国家自然科学基金(81960484)内蒙古自然科学基金项目(2021BS08009)
论文发表日期：2025-02-18
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：17( 129-145 )
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