野生型与突变型ATP6V1B2基因表达载体的构建及功能鉴定
辛凤
袁永一
郭维维
韩东一
戴朴
1.解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所 北京1008532.解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所 北京1008533.解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所 北京1008534.解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所 北京1008535.解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所 北京100853
摘要：目的构建ATP6V1B2基因野生型及c.1516 C>T突变型和绿色荧光蛋白基因PEGFP的真核共表达载体，为指导ATP6V1B2基因的功能研究奠定基础。方法应用基因重组技术、限制性内切酶酶切技术、定点诱变及基因测序方法，构建并鉴定野生型(pIRES2-EGFP-ATP6V1B2)和突变型(pIRES2-EGFP-ATP6V1B2- c.1516 C>T)真核表达质粒。经脂质体介导转染293细胞系，荧光显微镜下观察二者的表达。检测转染细胞内V-ATPase的水解活性和H+转运活性。结果阳性重组子经酶切鉴定野生型和含有c.1516 C>T突变型ATP6V1B2基因片段，基因测序结果正确。重组野生型和突变型真核表达质粒转染293细胞系24小时后，荧光显微镜下可见胞浆内有绿色荧光表达。转染48小时后检测突变型真核表达质粒转染的细胞V-ATPase水解活性降低，细胞溶酶体PH值升高。结论本研究成功地构建了ATP6V1B2基因野生型及c.1516 C>T突变型和PEGFP基因的真核共表达载体，且能在293细胞系中表达，功能研究证实c.1516 C>T突变导致V-ATPase水解活性降低，H+转运活性下降，细胞溶酶体酸度减低。
关键词：ATP6V1B2质粒表达
分类号：R349.6(基础医学)
资助基金：北京市自然科学基金面上项目(7132177)北京市科技新星计划(2009B34)国家科技支撑计划(2012BAI09B02)国家自然科学基金(81230020)国家自然科学基金(31071099,81070792，81371098)
论文发表日期：2013-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 335-339 )
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