人磷酸二脂酶基因反义RNA重组腺病毒载体的构建
赵永平
白文俊
闫征
陈国强
刘士军
邓庆平
王晓峰
1.北京大学人民医院泌尿外科,北京,1000442.北京大学人民医院泌尿外科,北京,1000443.北京大学人民医院泌尿外科,北京,1000444.北京大学人民医院泌尿外科,北京,1000445.北京大学人民医院泌尿外科,北京,1000446.北京大学人民医院泌尿外科,北京,1000447.北京大学人民医院泌尿外科,北京,100044
摘要：目的:探讨人磷酸二脂酶5(PDE5)基因反义RNA重组腺病毒载体的构建方法.方法:根据基因库确定具有完整PDE5A1启动子活性的cDNA基因序列,并设计反义链,两端加内切酶修饰;通过转载体克隆方法构建转入载体(pENTR)并测序;借助Gateway腺病毒表达载体系统进行重组反应构建重组腺病毒表达载体pAd/CMV/V5/antisense-PDE5A1;Pac Ⅰ酶切后转染293A细胞系进行包装、扩增;病毒质粒酶切后电泳鉴定及PCR检测;CsCl梯度离心法纯化病毒,病毒空斑实验进行滴度测定.结果:pENTR载体测序证实目的基因序列及插入方向正确;pAd/CMV/V5/antisense-PDE5A1酶切后电泳鉴定,可见145 bp的片段;PCR检测证明实验设计的目的反义基因成功插入腺病毒载体中;重组腺病毒滴度达108～1010/μl.结论:借助Gateway腺病毒表达载体系统可成功地将人工合成的反义基因装入到腺病毒载体中;纯化病毒液量和滴度符合体内基因转染实验的要求.
关键词：磷酸二脂酶重组腺病毒反义核酸载体
分类号：Q55(酶)R737(泌尿生殖器肿瘤)
资助基金：国家自然科学基金(30150002)国家自然科学基金(30371419)
论文发表日期：2005-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 331-334 )
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