基于ALKBH5调控GSK3β/mTOR通路抑制过度自噬探讨速效救心丸减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制
李檫
李益萍
王可妍
王丹
王肖龙
上海中医药大学附属曙光医院,上海市宝山区中西医结合医院(上海 201203)
摘要：目的:基于HL-1细胞自噬水平及相关通路关键蛋白表达探讨速效救心丸经Alk B同源蛋白 5(ALKBH5)信号转导调控糖原合成酶激酶 3β(GSK3β)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路抑制过度自噬而发挥对心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤保护作用的机制.方法:构建慢病毒干扰载体,筛选最佳干扰慢病毒.将 HL-1细胞随机分为 3 组,并进行空白转染、ALKBH5 转染、GSK3 转染,各组再随机分为 4组分别进行缺氧/复氧(模型组)、缺氧/复氧+速效(速效组)、缺氧/复氧+川芎嗪(川芎嗪组)、缺氧/复氧+冰片(冰片组)处理.通过自噬双标腺病毒(mRFP-eGFP-LC3)双荧光染色检测自噬流,细胞计数法(CCK8)检测细胞增殖,双染色双变量流式细胞分析法(Annexin V/PI)检测细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体的数量和形态,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测 GSK3β、mTOR含量及自噬相关基因(Atg)5、苄氯素 1(Beclin1)、自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链 3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、自噬标志物 p62 蛋白表达.结果:ALKBH5过表达可抑制 GSK3β表达,增强 mTOR表达(P<0.05).CCK8 法检测 mRFP-eGFP-LC3 的双荧光染色检测自噬流结果显示,与空白转染比较,ALKBH5转染可促进自噬,GSK3β转染可抑制自噬(P<0.05).CCK8 法检测细胞增殖结果显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组均可促进细胞增殖;与空白转染比较,ALKBH5组可抑制细胞增殖,GSK3β可促进细胞增殖(P<0.05).Annexin V/PI双染色法检测心肌细胞凋亡显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组均可抑制细胞凋亡;与空白组比较,ALKBH5转染及 GSK3β转染均可增加细胞凋亡(P<0.05).Western Blot检测 LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62 表达显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组可抑制 LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62 表达,增强 mTOR 表达(P<0.05).与空白转染比较,ALKBH5转染可增强LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,抑制mTOR表达;GSK3β转染可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,增强 mTOR表达(P<0.05).结论:速效救心丸及其有效成分冰片、川芎嗪经 ALKBH5/GSK3β/mTOR信号通路抑制过度自噬,减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤.
关键词：心肌细胞缺氧/复氧损伤速效救心丸Alk B同源蛋白5ALKBH5糖原合成酶激酶3βGSK3β雷帕霉素靶蛋白mTOR自噬实验研究
资助基金：国家自然科学基金(No.82174152)国家自然科学基金(82074222)上海市临床重点专科项目(No.shslczdzk05301)
论文发表日期：2023-12-16
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：10( 4510-4519 )
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