基质金属蛋白酶9介导线粒体自噬调控成骨及成肌

王思微; 姚啸生; 戚晓楠; 王禹; 崔海舰; 赵佳萱

doi:10.12307/2026.678

摘要：背景:基质金属蛋白酶9可以影响成骨和成肌分化,但是其具体调控机制不甚清楚. 目的:探讨氧化应激损伤对小鼠MC3T3-E1细胞和C2C12细胞线粒体自噬的影响,进一步研究基质金属蛋白酶9作为关键分子通过介导PTEN诱导激酶1/Parkin信号通路调控线粒体自噬并影响成骨、成肌分化的作用. 方法:选取小鼠C2C12细胞和MC3T3-E1细胞进行分化与培养,分别设置对照组、模型组(H2O2诱导氧化损伤)、GM6001(基质金属蛋白酶9抑制剂)组、3-甲基腺嘌呤(PTEN诱导激酶1/Parkin通路抑制剂)组,各组细胞处理时间均为24 h.应用流式细胞术检测细胞内线粒体膜电位、活性氧水平;透射电镜观察细胞线粒体损伤及自噬情况;Western blot检测基质金属蛋白酶9蛋白表达;qRT-PCR和Western blot检测P62、微管相关蛋白轻链3、PTEN诱导激酶1、Parkin的mRNA和蛋白表达;Western blot检测MC3T3-E1细胞中成骨蛋白骨钙素、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2蛋白表达;qRT-PCR法检测C2C12细胞中成肌基因生肌因子5、生肌因子6、生肌决定因子1、肌细胞生成素mRNA表达. 结果与结论:①在MC3T3-E1细胞和C2C12细胞中,与对照组相比,模型组、GM6001组、3-甲基腺嘌呤组线粒体膜电位均降低,活性氧水平均升高;与模型组相比,GM6001组活性氧水平降低;与GM6001组相比,3-甲基腺嘌呤组活性氧水平升高;②透射电镜观察模型组线粒体损伤较为严重,线粒体自噬形成;GM6001组线粒体损伤情况有所改善;3-甲基腺嘌呤组线粒体损伤情况较模型组减轻,自噬程度减弱;③与对照组相比,模型组、GM6001组、3-甲基腺嘌呤组基质金属蛋白酶9蛋白表达升高;与模型组相比,3-甲基腺嘌呤组基质金属蛋白酶9蛋白表达显著降低;与3-甲基腺嘌呤组相比,GM6001组基质金属蛋白酶9蛋白表达显著降低;④与对照组相比,模型组P62 mRNA及蛋白表达降低,GM6001组进一步降低,3-甲基腺嘌呤组升高;与对照组相比,模型组微管相关蛋白轻链3Ⅱ、微管相关蛋白轻链3Ⅰ、PTEN诱导激酶1、Parkin mRNA及蛋白表达升高,GM6001组进一步升高,3-甲基腺嘌呤组降低;⑤在MC3T3-E1细胞系中,与对照组相比,模型组、GM6001组、3-甲基腺嘌呤组骨钙素、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2蛋白表达降低;与模型组相比,GM6001组骨钙素、骨桥蛋白表达升高;与GM6001组相比,3-甲基腺嘌呤组骨钙素、骨桥蛋白表达降低;⑥在C2C12细胞系中,与对照组相比,模型组、GM6001组、3-甲基腺嘌呤组生肌因子5、生肌因子6、生肌决定因子1、肌细胞生成素mRNA表达降低;与模型组相比,GM6001组上述成肌基因表达升高;与GM6001组相比,3-甲基腺嘌呤组上述成肌基因表达降低.结果表明,基质金属蛋白酶9在氧化损伤模型中高表达,其抑制剂可以增强氧化损伤环境下的线粒体自噬,这种调控是基于PTEN诱导激酶1/Parkin通路的激活,并对成骨、成肌分化具有促进作用.